gst pull down实验流程

蛋白-蛋白相互作用是蛋白质结构与功能研究中zui重要的方面之一。GST pull-down将靶蛋白与GST融合表达，并将蛋白固化在谷胱甘肽(GSH)亲和树脂上，作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”（目的蛋白），洗脱结合物后通过电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白。 

    "诱饵蛋白"和"捕获蛋白"均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行，操作方便。 

GST pull-down一般指用一个带GST tag的重组蛋白，与目的蛋白进行孵育，zui后用结合GST的Beads拉下相互作用复合物。co-IP一般是用某一蛋白的抗体，在细胞裂解液中与相应的蛋白结果，用Protein A/G将抗原抗体复合物拉下，zui后在拉下的复合物中检测目的蛋白的实验。二者都是用于检测蛋白相互作用的实验。区别是pull-down一般是验证in vitro相互作用；co-IP一般用于检测细胞水平的in vivo相互作用。特殊的，也有人在重组蛋白水平，利用抗原抗体的反应，来进行pull-down实验。但这种方法文献里用得很少，而且，该属于pull-down还是co-IP，本人没看到明确定义，个人认为应该属于pull-down。 

谷胱甘肽巯基转移酶(Glutathione S-transferase GST)Pull-down实验技术是用来鉴定蛋白间相互作用的体外实验技术之一。该技术的原理是，首先构建靶蛋白和GST的融合基因，导入细胞中表达出相应的融合蛋白，然后提取靶蛋白-GST融合蛋白，并将其固定在谷胱甘肽亲和树脂上后充当一种“诱饵蛋白”，将含有目的蛋白的溶液过柱，利用亲和层析纯化目的蛋白，从而在目的蛋白溶液中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”（目的蛋白），这种结合物经过梯度洗脱后通过SDS-PAGE电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白。“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。 

GST亲和层析和GST Pull-down方法基本原理是：利用重组技术将探针蛋白与GST融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH(Glutathione)亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。在病毒受体研究中，融合蛋白通常设计为病毒吸附蛋白(VAP)。这方面成功的例子有HBV。具体做法如下：将GST-融合探针蛋白(VAP)和GTH-Sepharose制成亲和层析柱，然后待分析的蛋白质混合液流经亲和层析柱，梯度洗脱，分离、收集各蛋白组分，这称为GST亲和柱层析(GST affinity column chromatography)。如果一开始待检蛋白就和GST-融合探针蛋白与GTH-Sepharose一起共同孵育，经离心收集洗脱复合物和洗涤后，再加入过量GTH获得相互作用蛋白的复合物，那么这种方法则称为GST pull down。GST亲和层析及相应的GST Pull-down方法的优点是敏感，对混合物中的所有蛋白均“一视同仁”， 也可用于受体功能的鉴定。缺点是GST有可能影响融合蛋白的空间结构，另外，蛋白质浓度对实验也有一定影响。 

酵母双杂交技术：许多真核生物的转录激活因子通常具有两个可独立存在的结构域，即DNA结合域(BD)与转录激活域(AD)。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域。不同来源的激活因子的BD区与AD结合后则可特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理，人们将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用就会使AD与BD形成完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。 

酵母双杂交系统由三个部分组成：

• 与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)；

②AD融合的蛋白表达载体，其表达的蛋白称靶蛋白(prey)；

③带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3、URA3、LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的营养缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因，有利于杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用系统中BD来源主要分为GAL4系统和LexA系统。后者因BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。近年来，开始出现了应用酵母双杂交技术进行病毒受体研究的成功报告，如麻疹病毒的绒猴细胞受体。李凌云等构建了表达“猎物”(prey)蛋白的质粒和表达病毒VAP“诱饵”(bait)蛋白的质粒，然后共转染同一酵母细胞，利用已建立的易感细胞cDNA文库，筛到了阳性克隆。酵母双杂交技术的优点是灵敏度高，特异性较好，缺点是容易出现假阳性和假阴性，而且对蛋白质在细胞中的定位有要求。为了克服上述缺点，人们进一步优化出所谓“双筛选系统”，即蛋白质相互作用必须同时激活两个以上报道基因，具有两种以上的相应表型才算是真的阳性结果。另外，人们也改造了酵母双杂交系统所用的载体系统，将在细胞浆内发生的蛋白质相互作用转移到细胞膜上进行，以此来更容易地筛选膜蛋白受体，如Ras recruitment system(RRS)。 

GST-pulldown操作流程 材料及试剂 

探针蛋白与GST融合的原核蛋白，裂解的细胞蛋白，或者组织蛋白提取物  细胞蛋白裂解液，

洗脱液： PBS及PBS+1%Triton-100 

PBS (1L) 

NaCl：   8g 

KCl：    0.2g 

Na2HPO4： 1.44g 

KH2PO4：  0.24g

加入800ml蒸馏水，用HCl调节溶液的pH值至7.4，zui后加蒸馏水定容至1L即可，高温高压灭菌！4℃保存备用！ 

PMSF  MW:174.19 工作浓度0.1-1mM，这里使用1mM，储存浓度100mM，将0.174g PMSF溶于10ml无水乙醇混匀即可！保持于-20℃或者4℃ 

（以下流程仅供研究已知原核蛋白A和真核过表达蛋白B相互作用） 

1 · 原核融合蛋白A的获得 

1.1 将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21(DE3)菌株 

1.2 挑取单个克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml试管里，37℃培养过夜 

1.3 将培养菌液转移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L锥形瓶中，37℃，225rpm培养至OD600≈1.0-1.5左右，加入适当浓度的IPTG，在适当温度下培养适当时间（诱导条件需要根据不同的蛋白做调整），6000g，10分钟，4℃离心收集细菌，去尽上清，将菌体至于-20℃放置O/N 

1.4 室温冻融菌体，马上置于冰上，每500ml培养液加入10-20ml细菌裂解液(BS+1%Triton-100+PMSF)吹打混匀 

1.5 冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总40-60分钟。至裂解液充分清凉 1.6 11000rpm，15分钟，4℃离心分离上清，-80℃保存备用 

2 真核融合蛋白B的获得 

2.1 将编码B蛋白的碱基序列克隆到编码标签蛋白（如HA,或者myc）的真核表达载体上，进行细胞转染 xq 

3 · 48小时后，取适量融合蛋白GST-A于冰上冻融 

4 · 取50-70ulGST-Beads(Immobilized Glutathione)到EP管中，用800ul PBS+1%Triton-100润洗一次，将冻融融合蛋白GST-A与之混匀，4℃层析柜旋转结合1小时。 

5 · PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。留取20ul(PBS+Beads)作Offer。 

6 · 同时，裂解真核融合蛋白B，去尽培养基，用PBS(RT)洗一次，加入300ul裂解液（以6well为例，PBS+1%Triton-100+ Cocktaier），4℃放置30分钟。 

7 · 吹打收集至1.5mlEP管，超声破碎。13000rpm，15分钟，4℃离心取上清。 

8 · BCA蛋白定量(optional)留取20ul做Offer，其余样品加入到已纯化蛋白的EP管中，用PBS补足液体到600ul左右，以便蛋白之间能充分结合！4℃旋转结合O/N。 

9·  PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。 

10·  40ul 5×loading buffer溶解beads上的蛋白，煮沸3分钟，高速离心，Run -SDS PAGE做Western Blot检测。用HA或者myc Blot。